浅谈干法气化过氧化氢灭菌

干法气化过氧化氢灭菌系统于1991年开始投放欧美市场，2000年以后，广泛应用于制药行业空间灭菌，欧美应用干法气化过氧化氢灭菌技术已近30年，是十分成熟的工艺，目前已越来越多的被中国制药行业接受和应用，其灭菌效果也能得到验证支持。

随着新版GMP的实施和推广，我国对无菌药品的生产提出了更高的要求。尤其是随着生物制药的快速发展，Single Use 技术越来越被广泛应用，厂房布局也越来越灵活，空间灭菌一直以来都是生物制药生产过程中的关键环节，为了提高产品的质量，选择合适的灭菌方式就显得尤为重要。在当前各种灭菌技术当中，干法气化过氧化氢(H₂O₂)灭菌被公认为最理想的灭菌方式。干法气化过氧化氢灭菌方式正迅速成为生物制药行业尤其是抗体、疫苗、CAR-T、干细胞等领域生物净化的新选择，其对生物指示剂——嗜热脂肪芽孢杆菌能够达到10⁶的杀灭率。

一、什么是干法气化过氧化氢灭菌？

干法（图1）过氧化氢灭菌的特点主要体现在“干”上面，“干”是指干的工艺，能使液态过氧化氢完全气化，并实时监控灭菌区域的相对湿度，严格控制在饱和湿度以下，避免过氧化氢在物体表面结露，大大降低腐蚀的风险。

图1. 干法工艺

湿法（图2）过氧化氢灭菌工艺主要技术特征为：整个灭菌过程不除湿，其灭菌相对湿度维持在95%-120%RH之间的过饱和状态，利用高湿高浓度快速达到灭菌效果。有一定腐蚀表面和设备仪器的风险，且冷凝残留的液化小液滴往往需要检测过氧化氢浓度。

图2. 湿法工艺

客观地说，为了有效控制微生物污染，大大降低过氧化氢对无菌环境和设备的腐蚀风险，生物制药企业和实验室或者相关单位往往优先选择干法工艺。

二、影响干法气化过氧化氢灭菌效果的因素有哪些？

首先，目标环境的温度不均匀，可能会造成灭菌气体在表面产生凝结。一般温度+/-2.5℃是能被接受的范围。需要注意的是那些环境中的高温表面，例如，冻干机、灌装机等设备的CIP/ SIP功能，会造成局部表面的高温，需要待这些位置冷却（一般低于40℃）才能进行过氧化氢灭菌。另外，高温会由于热辐射改变环境中气流的状态，使得局部的过氧化氢气体无法到达这些部位。

其二，若目标环境的初始相对湿度过高，环境能容纳和吸收的水分只需很少就能达到饱和，这就使灭菌过程越容易产生凝结，气态过氧化氢浓度会降低，影响灭菌效果。湿度的均匀性会受温度均匀性影响，温度高的表面相对局部的湿度也会偏低一些。

第三，过氧化氢的用量是灭菌过程中较为可靠也是较为可控的参数。因此过氧化氢的总用量对于灭菌的效果而言是关键参数。灭菌区域体积确定的情况下，过氧化氢的用量是灭菌效果的重要考量因素。

第四，环境中过氧化氢的浓度。在灭菌过程中，过氧化氢本身在不断产生，同时也在不断分解。维持过氧化氢浓度在一定的水平是大多数灭菌系统厂家的做法，目前大多使用电化学的过氧化氢浓度传感器作为检测手段，但作为干法工艺的代表---德国PEA过氧化氢灭菌系统采用的是电容式过氧化氢浓度传感器，其自动加热功能可以避免过氧化氢在传感器表面产生结露，从而使测量更精确，该电容式过氧化氢传感器厂家在国内设有校准实验室。但是需要注意的是，空间中的过氧化氢浓度并不能直接说明灭菌效果的好坏。但是作为一个灭菌循环的参数，检测其浓度却是必须的，可以通过浓度的数据分析灭菌循环中的问题。

第五，灭菌维持时间也是需要考虑的因素，一方面要有一定的时间让过氧化氢气体扩散和接触，另一方面不同灭菌空间布局，用量不同，维持的时间长短也不一样，这需要在灭菌前进行参数开发。

第六，灭菌区域里的装载条件如设备设施的位置会影响过氧化氢气体的分布，从而影响灭菌效果，对于一些特别难于分布的远角，死角，设备背面等地方，需要在参数开发时进行重点考量。

第七，将灭菌气体传送到目标环境（如洁净区）的方式尽量避免利用长管路传送，如果没有对管路进行保温，背景环境温度又相对较低，那么过氧化氢会在管道内部产生凝结，传递到目标环境中的H₂O₂就会相对降低。

总之，灭菌效果是目标环境温湿度条件、过氧化氢溶液用量、过氧化氢气化状态及浓度、灭菌时间、装载条件、过氧化氢传送方式等综合的影响结果。判断是否达到灭菌效果的唯一标准是生物指示剂：嗜热脂肪芽孢杆菌ATCC 12980或ATCC 7953（数量级≥1.0×10⁶），在培养箱[55℃-60℃]中培养7天，结果无微生物生长证明达到6log灭菌效果。

三、干法气化过氧化氢灭菌可选择的两种方式

1.传统型：集成式过氧化氢灭菌系统

图3. 集成式过氧化氢灭菌示意图

集成式是将过氧化氢灭菌系统集成到空调管路上（图3），灭菌过程是由空调机组运行内部循环，将过氧化氢传送到各灭菌区域，这就对空调管路的材质，密封性要求比较高，如果传输管路太长，如何监控和保证空调管路内的冷凝状况仍然是一大难题，对于房间多，空间大的厂房，验证会受到挑战，虽然一套过氧化氢灭菌系统可以对不同的空调机组控制区域进行分别灭菌，因管路设计及安装施工复杂，前期投入大，大多数企业只用集成式过氧化氢灭菌系统应用到AB级区，满足其无菌保证需求，而AB级空间也相对较小，根据工艺不同，使用频次也较低，虽然其操作比较方便，但从性价比角度来说这并不是最好的选择，同时，选择集成式过氧化氢灭菌之前需要考虑以下几方面：

厂房设计时要考虑好方案，需确认安装位置，管路材质，与空调系统的连接方案等；

如何监控和保证过氧化氢气体在空调管路里不冷凝？

管路材质的选择，管路的密封性等；

事先考虑房间布局结构，房间空气流型，对顶部死角的灭菌效果影响；

2.新趋势：移动式过氧化氢灭菌系统

随着生物制药的快速发展，工艺的灵活性越来越高，功能性房间数量达到几十甚至上百个，为了避免交叉污染，降低风险，除了AB级区需灭菌外，CD级也有灭菌需求，集成式过氧化氢灭菌系统因其安装位置固定，需要分别对单独空调机组对应的功能区域灭菌，越来越不能满足生物制药工艺灵活的发展趋势。近年来，随着抗体行业，细胞治疗行业的兴起，采用移动式过氧化氢灭菌系统因其使用效率高，能灵活组合对不同生产区域进行一次性灭菌（图4），操作简便，数据完整，过程控制，易验证等诸多优点，越来越被生物制药行业广泛应用，大多移动式灭菌系统具备以下特征：

兼容性：采用知名品牌PLC，进行过程控制，能与BMS连接；

安全性：远程控制，紧急停止，审计追踪；

数据完整性：实时监测和记录测试数据，数据PDF输出，数据精确可靠；

合规性：符合现行GMP,FDA法规

便利性：安装调试周期短，操作简便，易通过验证；

灵活性：灵活组合对不同空间大小，不同功能区域灭菌，使用效率高；

EHS：灭菌结束后，过氧化氢快速降解为水和氧气，能保证对环境和人的安全；

图4. 移动式过氧化氢灭菌组合图

四、干法移动式灭菌应用实例分析

中国GMP 2010修订版附录三，关于生物制品的厂房与设备第十五条有如下表述：在生产过程中使用某些特定活生物体的阶段，应当根据产品特性和设备情况，采取相应的预防交叉污染措施，如使用专用厂房和设备、阶段性生产方式、使用密闭系统等。

抗体药物作为生物制品的典型代表，需要遵循以下特点：平面布局合理，严格划分区域，防止交叉污染，方便生产操作，尽量减少洁净区面积，提高生产线的使用效率。同时控制不同批次间活生物体的相互污染，包括未除病毒中间体污染已除病毒中间体的风险，要求做到不同的操作间处理不同的工序，各工序在空间完全隔离，且空调系统相对独立，这对空间灭菌的灵活性提出了更高的要求，以下将结合抗体药物某条生产线工艺，以其生产车间的空间灭菌为例，阐述某抗体企业选择干法移动式灭菌的合理性。首先见下图抗体的工艺和车间布局图：

图5 种子扩增环节（C+A级）

图6 生物反应器，生产罐，收获环节（C+A级）

图7 捕获，灭活，纯化环节（C+A级）

图8 配制分装环节（B+A级）

抗体药物为非最终灭菌产品，生产过程中非常注重物理隔离和过程控制，以防止微生物污染，所以整个工艺需要对生产环境进行有效控制，保证生产环境洁净无污染。该抗体公司生产区（图9）有超过10组空调系统，所需灭菌房间数约100多间，面积多达1600㎡，需灭菌的空间体积共计超过4500m³，以下是两种灭菌方式的设计方案（图10和图11）：

图9 某公司生产车间布局图（局部）

根据不同的空调机组分别灭菌，需要分13次才能将所有生产区域完成灭菌。

图10 集成式过氧化氢灭菌系统方案

2套过氧化氢发生系统和3套分布降解系统根据不同的拆分和组合方案，灭完所有6个区域所需的次数仅8次

图11 移动式过氧化氢灭菌系统方案

以上两种不同灭菌方案的成本分析：

图12. 成本分析

综上，由上述方案我们可以看出：

一套集成式过氧化氢灭菌系统，需要根据不同机组分13次才能对整个生产车间进行全部灭菌；
而移动式过氧化氢灭菌系统，因其灵活的组合性，只须分8次就可以对整个生产车间区域进行全部灭菌，为客户能大大节约时间成本，满足其灵活的生产方式；同时，由于集成式管路设计及安装调试复杂，成本上移动式灭菌系统更具价格优势；
移动式过氧化氢灭菌系统可以用于不同生产线的灭菌，大大提高使用效率；
集成式灭菌系统需要在厂房设计阶段就要介入，尤其是对于生产车间已经建好了的公司，移动式过氧化氢灭菌系统是其最好的选择；
移动式过氧化氢灭菌由于其灵便性，可以满足紧急灭菌需求，如梅雨季节洗衣房长霉菌等；
移动式过氧化氢灭菌可以灵活的适用于灭菌区域布局及功能性房间的变动和改造。

总之，随着2010修订版GMP的颁布和执行，干法移动式气化过氧化氢灭菌系统已在GMP生物制品的厂房及无菌转运过程中发挥重要作用，广泛应用于生物制品制药行业各个领域，它将开创中国空间灭菌的新市场，在今后几年内，一定会迅速成为制药空间灭菌设备市场的主流产品和选择趋势。

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