Countstar Rigel在悬浮培养MDCK细胞生产病毒疫苗的应用

采用动物细胞培养技术生产流感疫苗，是将病毒接种到传代细胞，并在生物反应器中大规模进行病毒繁殖以实现流感疫苗的规模化生产。目前，为满足日益增长的全球流感疫苗需求，提高工艺效率的研究工作势在必行。

MDCK细胞系可以用于多种病毒的繁殖和纯化，如流感病毒，RSV，副流感病毒1、2和 3，呼吸道合胞病毒，乳多空病毒，水泡性口膜炎病毒，痘苗病毒，柯萨奇病毒，呼肠弧病毒，细小病毒，腺病毒，骨髓灰质炎病毒，麻疹病毒，狂犬病病毒和疱疹病毒。尤其可用于流感病毒增殖。流感病毒在细胞内的扩增必然会受到感染时的细胞生理状态的影响。生理状态良好的细胞有利于病毒的感染复制，可提高流感病毒在细胞内的扩增效率。细胞在生长过程中其生理状态是随时间不断变化的，其生产病毒的能力也会随之发生相应改变。因此，考察细胞在何时处于感染复制病毒的最佳生理状态成为一个关键研究点。

MDCK细胞在接种病毒后浓度活率的检测有利于监测细胞状态，成为确定收获病毒时间的重要指标。在接种病毒第二天后，MDCK细胞聚团严重，采用常规的台盼蓝计数方法不能有效检测细胞的浓度与活率。因为聚团导致活细胞识别不准确，导致活率偏低很多。如A图：

A.台盼蓝染色方法

若采用荧光计数方法，对细胞核有效染色计数，能得到准确的结果。如B图:

B.荧光染色方法

MDCK细胞培养过程中存在很严重的“失巢凋亡”现象-Anoikis，它是一种细胞程序死亡形式，是由于细胞与细胞外基质和其他细胞脱离接触而诱发的，即细胞一旦不黏附其它基质就会发生凋亡。这也同样印证细胞活率高时细胞的黏附力强，结团就相对严重。

在第三天检测接种病毒的MDCK细胞，明显细胞活率下降很多，同时结团率也下降。同时由于细胞碎片的大量产生给细胞计数浓度与活率带来困难。所以采用荧光染色方法是检测此类特殊样本的有效方法。荧光染料只对核酸进行染色，从而特定排除细胞碎片的干扰。

C.荧光染色方法

1. 悬浮培养接种流感病毒的MDCK，特定培养天数时的结团率高，可在收获细胞时添加少量的胰酶消化细胞，尽可能的得到单细胞悬液。

2. 漩涡振荡器不能将结团率高的细胞悬液很好混匀，可以采用移液器多吹打混匀，再计数效果好。

3. 对于特殊的细胞样本，例如此类接种病毒的细胞，以AOPI荧光染色为好，台盼蓝染色不能很好的区分碎片，杂质。