简介:
图1 .Countstar®F Rigel系统结合数字显微镜和图像分析功能的台面设备
仪器和材料:
1. Countstar Rigel 细胞分析仪
2. Countstar 样品板
3. 0.2% 台盼蓝染色液(CS0101001-50)
4. CHO 细胞系
5. DMEM 细胞培养基(Hyclone-SH30243.01) 胎牛血清(Hyclone-SH30084.03) 胰蛋白酶(Hyclone-SH30042.01)。其中,CHO 细胞系稳定表达 X 蛋白,用于评价原研药和仿制药的亲和力一抗:不同浓度梯度的 002-BMK1,002-BMK2,AB1, AB2, AB3, AB4, AB5, AB6, AB7, AB8, AB9, PCSK-9。其中,002-BMK1,002-BMK2 能特异性的与 X 蛋白结合(阳性抗体),PCSK-9 是阴性对照抗体。二抗:Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG(Biolegend) ,5µg/mL
6. 软件 GraphPad Prism5®
方法:
细胞培养条件
1. CHO细胞培养在完全培养基中,组成为:500mLDMEM培养基,2mML-谷氨酰胺,1.5g/L碳酸氢钠和10%胎牛血清。于37°C,5%CO2培养箱中培 养48 小时;
2. 消化收集细胞。
染色步骤
1、使用台盼蓝计数测定细胞浓度;
2、准备3*10^5 个细胞/每个反应;
3、细胞样品于400g下离心3-5 分钟,去上清,用100µLPBS重悬;
4、轻轻混匀细胞样品,于 400g 下离心 3-5 分钟,去上清,用 100µL Cellstaining buffer 重悬;
5、在细胞样品中加入不同浓度梯度的一抗,每种抗体最高浓度为 10µg/mL,4
倍梯度稀释,最低浓度为 0.01µg/mL;
6、37℃下,避光孵育 60 分钟;
7、细胞样品于400g 下离心 3-5 分钟,去上清,用 100µL PBS重悬;
8、轻轻混匀细胞样品,于 400g 下离心 3-5 分钟,去上清,用 100µL Cellstaining buffer 重悬;
9、在每个反应组内加入 5µg/mL 二抗;
10、常温下,避光孵育 30 分钟;
11、细胞样品于400g 下离心 3-5 分钟,去上清,用 100µL PBS重悬;
12、轻轻混匀细胞样品,于 400g 下离心 3-5 分钟,去上清,用 100µL Cellstaining buffer 重悬;
13、混匀样品,加入 20µL 于细胞计数板中,上机检测。注:以上操作可使用 EP 管或 96 孔板。
不同抗体梯度稀释添加剂量
选用96孔板测定不同抗体与CHO细胞反应的剂量效应实验,包括原研药、抗体药和阴性对照(图2)。一抗浓度按照下表指示梯度降低(10µg/mL-0.01µg/mL)。
图2. 96 孔板中抗体浓度. 每孔中有CHO细胞(30 万个),二抗(5µg/mL)及图示 一抗(0.01, 0.039, 0.156, 0.625, 2.5, 10µg/mL).其他孔为空.
图 4. 抗体亲和力定量分析结果.A.不同浓度梯度抗体下不同抗原抗体反应中平均荧光强度.B.原研药和仿制药的分析结果比较
总结:
Countstar Rigel 系统提供了一个快速,直接,容易的方法评价抗体亲和力。此外,它是融合了电子显微镜,图像处理,自动细胞计数于一体的设备。另外,Countstar Rigel提供扩展功能,用户可以根据自身需要进行定制。Countstar Rigel是一款高度可移动的设备,内置多种预设程序,便于用户快速获取准确,稳定,可高度重现的数据。仪器中每个应用模块简单易用,大大简化了常规实验室的工作,给客户提供高质量的科研数据。Countstar Rigel 为客户开展抗体亲和力实验提供一个直接可靠的实验结果。